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　　基因載體是基因工程的核心，也是基因治療中強有力的生物工具，我們先來認識和閱讀載體圖譜吧。

　　載體分類及載體組成元件

　　載體分類

　　1、按屬性分類：病毒載體和非病毒載體

　　病毒載體是一種常見的分子生物學工具，可將遺傳物質帶入細胞，原理是利用病毒具有傳送其基因組進入目的細胞，進行感染的分子機制?？砂l生于完整活體或是細胞培養中?？蓱糜诨A研究、基因療法或疫苗。用于基因治療和疫苗的病毒載體應具備以下基本條件：

　　(1)攜帶外源基因并能包裝成病毒顆粒;

　　(2)介導外源基因的轉移和表達;

　　(3)對人體不致病;

　　(4)在環境中不會引起增殖和傳播。

　　非病毒載體一般是指質粒DNA。

　　2、按進入受體細胞的類型分類：原核載體、真核載體、穿梭載體(含原核和真核2個復制子，能在原核和真核細胞中復制，并可以在真核細胞中有效表達)。

　　3、按功能分類：克隆載體、表達載體

　　克隆載體：具有克隆載體的基本元件(Ori，Ampr，MCS等)，可以攜帶DNA或外源基因進入受體細胞并克隆和大量擴增DNA(外源基因)的載體。

　　表達載體：克隆載體中加入一些與表達調控(具有轉錄/翻譯所必需的DNA順序)有關的元件即成為表達載體。

　　載體組成元件

　　1、復制起始位點Ori：即控制復制起始的位點。Ori的箭頭指復制方向，其他元件標注的箭頭多指轉錄方向(正向)。

　　2、抗生素抗性基因：可以便于加以檢測，如Amp+ ，Kan+

　　(1)Ampr：水解β-內酰胺環，解除氨芐的毒性。

　　(2)tetr ：可以阻止四環素進入細胞。

　　(3)camr：生成氯霉素羥乙?；苌?，使之失去毒性。

　　(4)neor(kanr)：氨基糖苷磷酸轉移酶，使G418(卡那霉素衍生物)失活。

　　(5)hygr：使潮霉素β失活。

　　3、多克隆位點：MCS克隆攜帶外源基因片段，它具有多個限制酶的單一切點，便于外源基因的插入。如果在這些位點外有外源基因的插入，會導致某種標志基因的失活，便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。還要再看外源DNA插入片段大小。質粒一般只能容納小于10kb的外源DNA。一般來說，外源DNA越長，越難插入，越不穩定，轉化效率越低。

　　4、P/E：啟動子/增強子

　　5、Terms：終止信號

　　6、加poly(A)信號：可以起到穩定mRNA作用

　　示例閱讀載體：

　　1.pENTER載體

　　1)human ORF + pENTER載體

　　2) CMV啟動子，T7啟動子

　　3) ORF的C端融合了Flag和His tag

　　4) 多克隆位點，常用AsisI 和 MluI(人源基因上不常見的)

　　4) SV40 poly(A)加尾信號

　　5) SV40啟動子啟動的puro標記

　　6) 2個腺病毒ITR序列和2個與腺病毒Ad5同源的序列，可用于將ORF序列同源重組到腺病毒載體，直接用于腺病毒的生產。

　　2.慢病毒載體

　　1)EF1a啟動目的基因(可添加小標簽FLAG或HIS等小標簽)

　　2)CMV啟動GFP，非融合抗性篩選標記Puro(便于做細胞株的穩篩)

　　3)WPRE(來自土撥鼠肝炎病毒的轉錄后調節元件)，放置在目的基因的上游，能加強轉基因的表達

　　4) cPPT(來自HIV-1整合酶基因)，增加慢病毒在宿主基因組的拷貝數，提高病毒滴度

　　5)第三代慢病毒載體，載體中還包含HIV-1基因組中的順式調節元件(ψ 包裝 信號和LTR 長末端重復序列，其中3’LTR增強子功能缺失，5’LTR中U3區替代為CMV，更加安全的病毒載體)

　　3.腺相關病毒載體

　　AAV表達載體包括了中兩個ITR + CMV(可替換其他組織特異性啟動子，見改造載體部分)+ globin intron 內含子序列 + 目的基因 + poly A序列

　　選擇載體

　　選擇載體主要依據構建的目的，同時還要考慮載體中應有合適的限制酶切位點等。如果構建的目的是要表達一個特定的基因，則要選擇合適的表達載體。選用哪種載體，還是要結合目的基因及載體特點以實驗目的為準繩。

　　載體選擇主要考慮下述3點：

　　1、構建DNA重組體的目的，克隆擴增/表達表達，選擇合適的克隆載體/表達載體。

　　2、載體的類型：

　　(1)克隆載體的克隆能力—據克隆片段大小(大選大，小選小)。尤其對于病毒載體來說，載體包裝容量的大小是評估能否成功包裝病毒的首要因素。

　?、傧俨《究梢圆迦腴L約8kb的外源基因。目前，我們包裝過長度為7.5kb外源基因的腺病毒。

　?、诼《镜陌b容量約為6kb(包含載體帶有的其他抗性基因或報告基因)，但是2kb以上的外源基因包裝慢病毒難度就增加了，增大1kb會下降1個單位數量級的滴度，故2kb以上的基因包裝慢病毒需要進行評估。此外，毒性蛋白、凋亡蛋白和膜蛋白(作為受體、轉運蛋白行使功能)等由于其本身的功能，包裝可能會有一定難度。

　　③AAV的總包裝容量是4.7 kb(包含載體中兩個ITR約0.3kb +具體啟動子 + 內含子約0.6kb + 具體熒光標簽 + polyA約0.2kb)，所以插入目的基因一般約2kb 左右。由于AAV包裝容量有限，目的基因大于2kb，可考慮去除內含子，因為內含子只是有助于插入的目的基因穩定表達。

　　(2)確定表達蛋白的目的，然后再來選擇優勢的表達質粒。一般分為原核表達和真核表達質粒，前者主要用于體外純化蛋白，如帶His-tag的PET系列，帶GST-Tag的PGEX系列，選用不同的表達載體，就得建立相應的純化系統，包括緩沖液的配置、珠子/柱子的選擇等等，還得考慮目的蛋白的可溶性，一般大tag的融合蛋白可溶性要好一些，如GST的。這種原核純化的蛋白一般用來制備單一的、需要量大的蛋白。真核表達載體一般是細胞、體內表達等需要時所用，只需要將它放到細胞或體內細胞即可，唯yi考慮的是它的啟動子的選擇，常用都是cmv啟動子的，表達效率較高，也有多種啟動子經過改造的表達載體，一般用來表達需要調控表達時間及表達量的蛋白。

　　3、載體MCS中的酶切位點數與組成方向因載體不同而異，適應目的基因與載體易于連接，不產生閱讀框架錯位。

　?、龠x分子量小的質粒，即小載體(1-1.5kb)→不易損壞，在細菌里面拷貝數也多(也有大載體);

　　②一般使用松弛型質粒在細菌里擴增不受約束，一般10個以上的拷貝，而嚴謹型質粒<10個;

　?、郾匦杈邆湟粋€以上的酶切位點，有選擇的余地;

　?、鼙匦栌幸讬z測的標記，多是抗生素的抗性基因。

　　選擇載體還需注意：

　　無標簽載體，起始/終止密碼子都要添加!

　　標簽在N端的載體，終止密碼子要添加!

　　標簽在C端的載體，起始密碼子要添加!